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      2. 021-53309123
        咨詢熱線:
        關于怎樣使用血管內皮細胞生長因子 (VEGF)ELISA試劑盒的明細
        2017-08-25

        本試劑僅供研究使用
        目的:本試劑盒用于測定人血清,細胞上清及相關液體樣本中血管內皮細胞生長因子(VEGF)的含量。
        實驗原理:
        ? 本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人血管內皮細胞生長因子(VEGF)水平。用純化的人血管內皮細胞生長因子(VEGF)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入血管內皮細胞生長因子(VEGF),再與HRP標記的血管內皮細胞生長因子(VEGF)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血管內皮細胞生長因子(VEGF)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中人血管內皮細胞生長因子(VEGF)濃度。
        試劑盒組成:
        試劑盒組成48孔配置96孔配置保存
        說明書1份1份
        封板膜2片(48)2片(96)
        密封袋1個1個
        酶標包被板1×481×962-8℃保存
        標準品:1350pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
        標準品稀釋液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存
        酶標試劑3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
        樣品稀釋液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
        顯色劑A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
        顯色劑B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
        終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
        濃縮洗滌液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存

        樣本處理及要求:
        1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。
        2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。
        3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
        4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
        5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
        6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融.
        7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
        操作步驟
        1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔,在第一、第二孔中分別加標準品100μl,然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl,混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,再各取50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl,混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl,濃度分別為900pg/ml,600pg/ml ,300 pg/ml,150 pg/ml,75 pg/ml)。
        2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品*終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
        3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
        4. 配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。
        5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
        6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
        7. 溫育:操作同3。
        8. 洗滌:操作同5。
        9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.?
        10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
        11. 測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
        注意事項:
        1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
        2. 濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
        3. 各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間**控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
        4. 請每次測定的同時做標準曲線,**做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請**乘以總稀釋倍數(×n×5)。
        5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
        6. 底物請避光保存。
        7. 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
        8. 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
        9. 本試劑不同批號組分不得混用。
        10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。
        計算:
        以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,????
        在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD??????
        值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋??????
        倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標?
        ?????
        ?
        ???????????? (此圖僅供參考)
        ?
        準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。?
        試劑盒性能:
        1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
        2.批內與批見應分別小于9%和11%
        檢測范圍:??????????????????????????????????????????????
        30pg/ml-1200pg/ml????????????????????????????????????????
        ????????????????????????????
        保存條件及有效期:
        1.試劑盒保存:;2-8℃。
        2.有效期:6個月


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