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      DNA分子的限制性內切酶消化操作步驟
      2017-08-25

      一、限制性內切酶對DNA消化的方案

      1.限制性內切酶反應在滅菌的0.5ml離心管中進行。

      2. 20μl體積反應體系如下:

      DNA 0.2-1 μg

      10×酶切buffer 2.0 μl

      限制性內切酶 1-2 u(單位)

      ddH2O  20 μl

      限制性內切酶**加入,輕輕混勻,稍加離心,放置于*適溫度水浴并按所需的時間溫育,一般為37℃水浴消化3hr。

      3.用于回收酶切片段時,反應總體積可達50-200μl,各反應組分需相應增加。

      4.多種酶消化時若緩沖液條件相同,可同時加入;否則,先做低溫或低鹽的酶消化,再做高溫或高鹽的酶消化。

      5.酶切結束時,加入0.5M EDTA(pH 8.0)使終濃度達10mM,以終止反應?;驅⒎磻茉?/span>65℃水浴放置10min以滅活限制性內切酶活性。

      6.如消化反應體積過大,電泳時加樣孔盛不下,可加以濃縮:終止反應后,加入0.6體積的5M乙酸銨(1/10體積3M NaAc)2倍體積無水乙醇,在冰上放置5min,然后于4℃離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE(pH 7.6)。

      7.如要純化消化后的DNA,可用等體積酚/氯仿(11)和氯仿各抽提一次,再用乙醇沉淀。

      二、電泳檢測

      取質粒酶切產物適量,加適當loading buffer混勻上樣,以未經酶切的質?;?/span>/和酶切的空載體(如有)作對照,采用 1-5V/cm的電壓,使DNA分子從負極向正極移動,至合適位置取出置紫外燈下檢測,攝片。

      三、注意事項

      1. 濃縮的限制性內切酶可在使用前以1×限制酶緩沖液稀釋,切勿用水稀釋以免酶變性。

      2. 購買的限制性內切酶多保存于50%甘油中,于-20℃是穩定的。進行酶切消化時,將除酶以外的所有反應成分加入后即混勻,再從-20℃冰箱中取出酶,立即放置于冰上。每次取酶時都應更換一個無菌吸頭,以免酶被污染。加酶的操作盡可能快,用完后立即將酶放回-20℃冰箱。

      3.盡量減少反應體積,但要確保酶體積不超過反應總體積的10%,否則酶活性將受到甘油的抑制。

      4.通常延長時間可使所需的酶量減少,在切割大量DNA時可用。在消化過程中可取少量反應液進行微量凝膠電泳以檢測消化進程。

      5.注意星號酶切活力。


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